細胞凍存與復蘇是一種用于長期儲存細胞的技術。在這個過程中，細胞被置于低溫環境中，減緩其代謝活動。通過將細胞冷凍保存在液氮中（通常為-196℃），細胞暫時脫離生長狀態，但其細胞特性得以保存。當需要時，可以通過復蘇將這些凍存的細胞重新激活，以供實驗使用。這種方法能夠適度地保存一定數量的細胞，防止細胞受到污染或其他意外事件的影響，從而發揮了細胞保種的作用。
本文將為大家介紹細胞凍存與復蘇的技術要點和操作步驟。
細胞凍存原理
當細胞降溫至零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。
如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，以防止細胞內形成大冰晶；相反，結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。
低溫保護劑的應用原理
1、在細胞凍存時加入低溫保護劑，增加細胞滲透壓穩定性，減緩慢速降溫過程中的脫水皺縮現象，能大大提高凍存效率；
2、常用的低溫保護劑是DMSO（二甲基亞砜），它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。
細胞凍存方法
方法一：使用程序凍存盒
步驟1：配制程序凍存液，放在室溫備用或放在4℃預冷
步驟2：離心收集對數生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心，懸浮細胞直接離心，轉速1200rpm或250g，時間3min）
步驟3：用配制好的凍存液重懸細胞，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中，擰緊管蓋，做好標記
步驟4：凍存管放入凍存盒，凍存盒放入-80℃冰箱過夜（24h）
步驟5：凍存管從凍存盒取出，轉移至液氮長期保存
▲ 使用凍存盒操作示意圖
方法二：使用無血清非程序凍存液
步驟1：從冰箱拿出無血清非程序凍存液，待用
步驟2：離心收集對數生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心，懸浮細胞直接離心，轉速1200rpm或250g，時間3min）
步驟3：棄上清，加入適量無血清非程序凍存液，重懸細胞
步驟4：按照1~1.5mL/管的量分裝到凍存管中，擰緊管蓋，做好標記
步驟5：將凍存管直接移入-80℃冰箱中，24h后轉移至液氮長期保存
▲ 使用無血清非程序凍存液操作示意圖
方法三：手動梯度降溫
步驟1：配制程序凍存液，放在室溫備用或放在4℃預冷
步驟2：離心收集對數生長期的細胞（貼壁細胞消化下來離心，懸浮細胞直接離心，轉速1200rpm或250g，時間3min）
步驟3：用配制好的凍存液重懸細胞，按照1~1.5mL/管分裝到凍存管中，擰緊管蓋，做好標記
步驟4：凍存管按照【4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（24h）→液氮】的順序放置
▲ 手動梯度降溫操作示意圖
細胞復蘇原理
復蘇時，一般以很快的速度升溫，1-2分鐘內即恢復到常溫，細胞內外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質溶液中過長的時間，從而無冰晶損傷和溶質損傷產生，凍存的細胞經復蘇后仍保持其正常的結構和功能。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復溫速率有關。
細胞一般采用快速融化以避免慢速融化水分滲入細胞內再次形成胞內結晶損傷細胞。
細胞復蘇方法
步驟1： 取出凍存管，從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動，促使其盡快融化。
步驟2：處理細胞懸液，從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，將其加入離心管中，并滴加10倍以上的培養液，然后混勻。
步驟3：離心，進行1,000 rpm，5分鐘的離心。
步驟4：調整細胞密度，棄去上清液，加入含10%小牛血清的培養液以重懸細胞。進行計數，調整細胞密度后，將其接種到培養瓶中，并置于37℃培養箱中，靜置培養。
步驟5：繼續培養，次日更換一次培養液，繼續進行培養。
細胞凍存、復蘇注意事項
1. 確保細胞狀態良好：在凍存之前，確保細胞具有良好的形態，并且沒有污染。
2. 選擇適合的凍存液：根據細胞類型選擇合適的凍存液，并按照相應的操作規程進行細胞的凍存。
3. 控制細胞密度：要控制好細胞的密度，避免過低或過高影響凍存效果。不同的凍存液針對不同細胞有適當的凍存密度范圍，以確保細胞在冷凍和復蘇過程中的存活率。
4.盡快冷凍：細胞懸液加入凍存液后盡量短時間在常溫放置，因為常溫下DMSO對細胞會造成損傷。建議盡快通過程序降溫或一步法等方式進行細胞的冷凍保存。
5. 合理存放：細胞長期存放在-80℃冰箱時，建議靠冰箱內側放置樣本，避免開關冰箱導致溫度不穩定影響細胞保存效果。
6. 檢測存活率：細胞凍存后應取出一管進行復蘇，并檢測細胞的存活率。為穩妥起見，可在細胞凍存半年后進行復蘇培養，并觀察細胞生長情況后繼續凍存。
7. 溫和解凍：使用適當的方法解凍細胞，如將凍存管放入37°C的水浴中直至完全解凍。避免使用高溫或暴露時間過長的方法，以減少DMSO對細胞的毒性作用。
8. 勻速搖晃：細胞融解過程應勻速、均一地搖晃以加速融解，同時避免流體剪切力對細胞的損傷。
9.盡快去除DMSO：已融解的凍存細胞應盡快在常溫下存放，并盡快離心去除DMSO。
